从工业废水污泥中分离群体淬灭细菌控制生物膜污染

一、工业MBR中QQ菌株的分离与鉴定

 Fig. 1. 16S rRNA gene-based phylogenetic tree generated using a NeighbourJoining algorithm showing the phylogenetic position of the isolates. The horizontal bar at the bottom represents the evolutionary distance as a change of 0.02 per nucleotide position as determined by measuring the length of the horizontal lines connecting the species. The numbers (bootstrap values as percentages of 1,000 replications) provide support for the robustness of the adjacent nodes.图1 利用NeighbourJoining算法生成基于16S rRNA基因的系统发育树，显示了分离株的系统发育位置。底部的水平线表示进化距离的变化为0.02，通过测量连接物种的水平线的长度来确定每个核苷酸位置。数值 (bootstrap值为1 000次重复的百分比) 为相邻节点的稳健性提供了支持。

富集培养后，从R2A、Nutrient和LB琼脂平板上分离出53个菌落。在53株分离株中，有10株表现出明显的QQ活性 (即C8 - HSL在1 h内降解> 50 %) 。10株分离株被分别标记为SDC - U1、- U2、- U3、- A1、- A2、- A8、- A10、- A11、- D14和- D15。而SDC - D14、- D15、- A1和- A2在1 h内对C8 - HSL的降解率仅为50 - 80 %，表现出中等强度的QQ活性，其余6株菌均表现出非常好的QQ活性，完全降解C8 - HSL。16S rRNA分析表明，10株菌与Bacillus cereus ATCC 14，579 (99.93 %) 、Bacillus toyonensis strain BCT-7112 (100 %) 、Stenotrophomonas pavanii strain LMG 25，348 (99.72 %) 和Gordonia otitidis NBRC 100,426 (99.93%) 具有较高的相似性。进一步的系统发育分析支持了SDC - U1、- A8、- D14和- A1与这些菌株紧密聚类的结论(图1) 。本文重点分析的两株菌为芽孢杆菌属Bacillus sp . SDC - U1和- A8,它们在系统发育上非常接近。然而，两种菌株的菌落形态存在明显差异；SDC - U1呈青白色，黏液状，表面粗糙；SDC - A8呈浅白色，无光泽，边缘光滑。这些形态上的差异，以及后续分析的不同性质如QQ活性、生长速率等，表明SDC - U1和- A8是明显不同的菌株。

二、芽孢杆菌SDC-U1和- A8表征。

在10株分离菌株中，选取QQ活性最高的SDC - U1和- A8进行下一步分析。采用交互共生试验测定菌株产AHL的能力。菌株SDC - U1和- A8没有观察到AHLs的释放，而阳性对照PAO1产生的AHL信号达到A136报告菌株，导致在X - gal存在下出现紫色色素。因此，确定分离得到的SDC - U1和- A8菌株是能够降解QS分子的淬灭剂，而不是AHL产生菌。

在好氧条件下，分离得到的QQ菌株SDC - U1和- A8均在(5 ~ 10 h) 前期的LB肉汤中快速生长，达到其指数生长期。经计算，SDC - U1和- A8的生长速率分别为0.926和0.937 h ^-1，远高于已报道的红球菌等QQ分离株。

为了确定菌株能否在无氧条件下生长，将分离得到的菌株在FTM中培养。巯基乙酸和L -胱氨酸是还原剂，刃天青(resazurin) 是氧指示剂，在氧气存在的情况下，顶层变为粉红色。证实SDC - U1和- A8均为兼性QQ细菌菌株，可同时在FTM的好氧区和厌氧区生长。在厌氧条件下的FTM中，SDC - U1和- A8均能快速生长，并在5 ~ 10 h内达到指数生长期。SDC - U1在厌氧条件下的生长速率(0 . 960h^-1) 与好氧条件下几乎相同，而SDC - A8在厌氧条件下的生长速率 (0. 476h^-1) 相对缓慢。因此，这两株菌均为兼性生长，在两种条件下均表现出较高的生长速率，有利于其在好氧和厌氧体系中的大量生产和大规模应用。

 

Fig. 2. C8-HSL degradation by strains SDC-U1 and -A8. (a) Whole-cell activity under aerobic (solid line) and anaerobic conditions (dashed line) . (b) QQ rate coefficient (k) of SDC-U1 and -A8 for various AHLs. The error bars represent the standard deviation (n = 2, technical replicates).

图2 菌株SDC - U1和- A8降解C8 - HSL。(a) 有氧(固相线) 和无氧 (虚线) 条件下的全细胞活性。(b) 不同AHL的SDC - U1和- A8的QQ速率系数(k)。误差条表示标准差(n = 2 ,技术重复) 。

对全细胞和上清液QQ活性进行分析，判断分离菌株是否具有内源性或外源性QQ活性。将过夜培养物分为上清液和全细胞样品，在初始浓度为200 n M的条件下，考察C8 - HSL随时间的降解情况。已有研究证实，C8 - HSL是活性污泥中主导的AHL信号分子。上清不降解C8 - HSL，但全细胞样品通过淬灭SDC-U1和- A8中的AHL信号而表现出QQ活性 (图2a ) 。这些结果证实了SDC - U1和- A8的内源性QQ活性，即它们的QQ酶储存在细胞内，并不主动分泌。

在好氧条件下，两株菌均表现出较高的QQ活性，能在短时间内完全降解AHL，但SDC - U1表现稍好 (图2a ) 。SDC-U1的QQ速率系数 (k) 高于SDC - A8，200 nM C8 - HSL分别在15和30 min内完全降解。在厌氧室中监测C8 - HSL (200 nM) 的降解情况。SDC - U1和- A8是兼性厌氧菌，它们在厌氧条件下表现出非常高的QQ能力 (图2a) ，尽管SDC - U1比SDC - A8具有更高的QQ活性和更快的降解速率，C8 - HSL分别在15和30 min内完全降解。因此，SDC - U1和- A8是在好氧和厌氧MBR系统中都有应用前景的QQ候选菌株。

此外，分析了SDC - U1和- A8降解多种AHLs的速率。如图2b所示，三株菌均表现出广泛降解AHLs的能力。它们对长链AHLs的降解速率均高于对短链AHLs的降解速率。在灭活C8 -、C10 -和3-oxo - C12 - HSL方面，SDC - U1表现出略高的效率，但总体而言，SDC - U1和- A8在灭活AHL方面没有明显差异。

 

Fig. 3. AHL restoration assays to confirm lactonase enzyme activity. The C8HSL degraded by SDC-U1 and SDC-A8 was recircularized via acidification. The error bars represent the standard deviation (n = 2, technical replicates).图3  AHL修复实验验证内酯酶活性。SDC - U1和SDC - A8降解的C8HSL通过酸化重新循环。误差条表示标准差(技术样品n = 2) 。

为了鉴定SDC - U1和- A8产生的酶的类型，通过酸化实验观察内酯环的恢复情况。AHL内酯酶可以水解高丝氨酸内酯的内酯环，导致QS信号分子的降解。该过程可以通过加入HCl溶液来恢复，表明必须降低pH来关闭内酯环。在酸性条件下培养30 min后，被SDC - U1和- A8完全降解的AHLs分别恢复到初始水平的42 %和74 %，表明这两株菌胞内均存在AHL -内酰胺酶。

 

Fig. 4. Effect of strains SDC-U1 and -A8 on the biofilm formation of (a) P. aeruginosa PAO1 and (b) activated sludge (A.S.) from an industrial MBR. The inoculum concentration of PAO1 (or A.S.) was fixed at an OD600 of 0.03 and the concentration ratio between PAO1 (or A.S.) and the QQ strain was 1:0.33, 1:1, or 1:3. The error bars represent the standard deviation (n = 3, biological replicates). One-way ANOVA and Tukey post-tests were conducted to compare QQ treatment to the PAO1 control where significant differences are indicated as follows: ***p < 0.001 and ****p < 0.0001.图4  SDC - U1和- A8对工业MBR中 (a) 铜绿假单胞菌PAO1和 (b) 活性污泥(A.S .) 生物膜形成的影响。PAO1 (或A . S .) 的接种浓度固定为OD600为0.03，PAO1 (或A . S .) 与QQ菌株的浓度比为1：0.33、1：1、1：3。误差条表示标准差 (n = 3 ,生物学重复) 。采用单因素方差分析(One-way ANOVA) 和Tukey post - test对QQ处理组和PAO1对照组进行比较，显著性差异如下：* * * p < 0.001和* * * * p< 0.0001。

将分离得到的QQ菌株与铜绿假单胞菌PAO1或活性污泥在微孔板中进行共培养，评估其生物膜还原效率。当PAO1和QQ菌株以1：0.33、1：1和1：3的比例共培养时，SDC - U1和- A8在QQ菌株的最高细胞浓度 (1：3) 下分别有效抑制了PAO1诱导的生物膜48 %和42 % (图4a) 。这似乎表明，PAO1产生的AHLs被共培养的QQ菌株不断降解，对生物被膜形成起重要作用的QS系统运行受阻，导致附着在微孔板孔表面的生物量减少。

为了确认QQ分离株对含四甲基氢氧化铵废水中混合微生物形成生物膜是否具有缓解作用，从处理四甲基氢氧化铵废水的工业MBR装置中收集废水和活性污泥，并应用于上述生物膜试验。SDC - U1和- A8对活性污泥混合菌群的削减效率分别高达65 %和61 %，甚至高于PAO1 (图4b) 。这些结果说明了SDC - U1和- A8在控制由工业MBR工厂活性污泥和PAO1形成的生物膜方面的有效性，并且SDC - U1比- A8具有更高的生物膜还原性能，这表明SDC - U1是MBR中用于生物污损削减的更好选择。

三、工业废水中的有毒化学物质对SDCU1和- A8的影响

 

Fig. 5. AHL degradation efficiency w/ or w/o TMAH. (a) Bacterial cell concentration adjusted to an OD600 of 1.0 and incubated for 10 min. (b) Bacterial cell concentration adjusted to an OD600 of 0.5 and incubated for 5 min. The error bars represent the standard deviation (n = 3, biological replicates). Bacterial growth in the presence of toxic chemicals: (c) SDC-U1 (d) SDC-A8.图5 . AHL降解效率w / or w / o TMAH。(a) 细菌细胞浓度调整为OD600为1.0，孵育10 min。(b) 调整细菌细胞浓度至OD600为0.5，孵育5 min。误差条表示标准差 (n = 3 ,生物学重复) 。有毒化学物质存在下的细菌生长： (c) SDC-U1 (d) SDC - A8。

同时考察了TMAH对2株分离菌株SDC - U1和- A8 QQ活性的影响。当SDC - U1和- A8与C8 - HSL共孵育10分钟至OD600为1.0时，在没有TMAH的情况下，C8 - HSL完全降解(图5a) 。添加20和100 mg / L的TMAH对两种菌株的QQ活性均无不利影响 (图5a)。同样将培养物浓度稀释至OD600为0.5，孵育时间缩短至5 min。SDC - U1和- A8在此条件下仍能完全降解C8 - HSL，其QQ活性不受100和500 mg / L TMAH添加的影响 (图5b ) 。这些结果表明，SDC - U1和- A8的高QQ活性不受高浓度TMAH存在的影响，这有利于用于处理该化学品的MBR。

目标工业废水的主要成分是四甲基氢氧化铵 (TMAH)，其好氧降解会产生氨和甲醛。本研究在观察细菌在LB肉汤中生长情况的基础上，对分离得到的菌株进行了毒性测试。研究了SDC - U1和SDC - A8在含20 - 100 ppm TMAH、20 - 100 ppm NH₄⁺和5 - 25 ppm HCHO的LB液体培养基中的生长情况。如图5c和5d所示，SDC - U1和- A8在20 ~ 100 ppm的TMAH和铵盐以及5 ppm的甲醛添加量下均不受影响。10 ppm HCHO的加入延缓了SDC - U1和- A8的指数增长，25 ppm HCHO的加入完全抑制了SDC - A8的生长，也严重影响了SDC - U1的生长。由于本研究采样的污水处理厂废水中含有100 - 200 ppm的TMAH，导致生物反应器中TMAH和NH₄⁺的浓度远低于100 ppm，因此TMAH和NH₄⁺对SDC - U1和- A8的毒性不会威胁到它们在MBR中用于生物污损控制。然而，HCHO可以影响SDC - A8的生存能力，即使在10 ppm时也会延迟- U1的细菌生长。因此，当使用这些QQ菌株在MBR中处理工业废水时，需要对反应器中的HCHO浓度进行监测。

5.主要结论

     从处理含TMAH工业废水的MBR污泥中分离得到QQ细菌。具有高QQ活性的芽孢杆菌Bacillus sp . SDC - U1和- A8对TMAH及其生物降解物表现出足够的抗性，并能有效减缓混合菌群和PAO1的生物被膜形成。这些QQ特征及其异常高的生长速率表明，它们是缓解处理有毒工业废水的MBR中生物污染的有希望的候选者。此外，该方法有望将一直局限于城市污水处理的QQ-MBR研究拓展到工业废水处理领域。